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PCR实验室污染?别急,华测实验室教你万能应急法

发布者:华测实验室 发布时间:2022-11-08 阅读:

PCR检测因其高灵敏度、快速、操作方便等优势已经被广泛应用,不过正是由于它灵敏度极高,极微量的污染源都有可能导致检测结果的假阳性,“假阳性”的出现给疫情防控带来了不小的麻烦。“易查不易察”,污染来的悄无声息,我们该如何应对。如何避免以及处理实验室污染,对PCR人来说是一门必修课。

 

PCR实验室污染?别急,华测实验室教你万能应急法


核酸检测作为是否感染新冠病毒的“金标准”,假阳性到底是如何出现的?

 

一、常见的四种污染

实验操作过程中造成污染是假阳性产生的原因之一,主要有4个途径:标本间交叉污染、PCR试剂污染、克隆质粒污染和PCR扩增产物污染。

 

1、样本间交叉污染

主要是在采(取)样的过程中,由于取样工具之间的交叉造成污染;或者在核酸提取的过程中,由于移液器、离心管等使用不当导致的污染。

 

·采集标本的容器被污染;

·标本放置时,容器密封不严;

·还有在不同样本移液时,未更换枪头或未使用带滤芯枪头导致移液器污染等。

 

2PCR试剂污染

主要是在 PCR 组分试剂加样过程中,由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。

 

3PCR扩增产物污染

这是 PCR 反应中最主要、最常见的污染问题。由于PCR产物拷贝量大,产物污染极容易导致假阳性的发生。
还有一种容易被忽视的污染,是能造成PCR产物污染形式的气溶胶污染,而气溶胶造成的污染是一个值得特别重视的问题。在扩增过程中或扩增结束后,PCR管盖未盖严或崩开会导致扩增产物泄露,形成气溶胶。

气溶胶扩散到实验室空气中,可能会落到PCR仪,台面,枪头盒等位置,造成污染。

 

4、克隆质粒污染

在实验操作中会经常用到阳性参考品,这些参考品大多数是由某些克隆质粒制作而成的,质粒在单位容积内浓度高,不小心使用极易造成污染。

 

 

二、实验室污染防治

现在新冠结果这么重要,实验室该怎么防污染呢?

PCR实验室防污染有很多措施,首先就是分区设计,严格的PCR实验室应分为:

①试剂储存和准备区

②标本制备区

③扩增区

④扩增产物分析区。

四个区还要单一流向,不能逆行。

 

如此下来实验室需要很大的面积,我们还可以采用样本处理、核酸提取及扩增检测一体的自动化分析仪,区域可以合并,两个区就行了,非常节省空间。

 

可能会有朋友问,全自动仪器不分区怎么防污染呢?

这就涉及到仪器内部通风系统的设置了,这也是核酸检测全自动分析仪设计的难点。我们要保障仪器内部分区设置科学合理,同时控制内部空气从低风险向高风险单向流动,洁污分离,避免交叉污染。

 

而对于最常见的扩增产物污染,该怎么解决?

其实目前扩增产物的污染并没有想象中这么严重,因为PCR多采用了UNG/UDG技术,显著降低扩增产物的污染,国内几乎所有获批的新冠检测试剂盒均采用了UNG防污染技术。我们重点关注的是PCR扩增管的密封性问题。正常情况下,我们看上去管子是盖的很紧,而PCR扩增过程是一个温度不断变化的过程,高温能达到90多度,如果PCR管密封不严,扩增过程中管盖可能会崩开或有炸管声音,还会造成PCR反应液蒸发,管内体积减少将直接影响结果,且会成为一个污染源。

 

是的,这么一个小小的管子,就是如此重要。任何一个小的操作环节都会对结果造成影响。对于PCR实验室,操作人员是一定要严格执行标准操作规程的。

 

像试剂污染,也说明人的操作行为是很关键的。那么该怎么更好解决试剂污染呢?

可能有朋友说,可以尽量减少人工操作环节,将PCR试剂直接单人份分装。这个方法是不错的,PCR试剂小量分装,可以减少反复冻融、重复取样次数和反复使用过程中的试剂污染。但目前,普通的PCR尚不能做到单人单管,而且扩增试剂大多为-20℃保存,存在反复冻融的问题。因此,这是一个保存条件的改进问题。

 

其实,我们还有非常多细节操作是可以防污染的,例如:

·在操作中勤换手套;

·吸头装上滤芯才能用;

·在PCR试验中加入内标、阴阳性对照等质控,监测检测结果等等。

 


污染,是 PCR 实验室出现实验假阳性、结果不可信、研发不可靠的重要推手。
在最初开展PCR实验室的时候,应最大程度的降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现,在前期的实验室设计及日常实验室管理和操作中,就需要进行合理的实验室规划以及严格执行实验室SOP,把污染的可能性扼杀在摇篮中。


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